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荧光显微镜光路系统中如何正确放置滤光片?

最近有客户反馈买回去的滤光片套装在安装时候出现无从下手甚至不知所措的情况,借此机会我们简单了解下荧光滤光片套装,它包含激发滤光片,二向色镜和发射滤光片各一片。其实想要正确安装滤光片并正常使用,真的不难。不信?您参看以下示意图就可轻松搞定:

Optolong的激发(Exciter)和发射(Emitter)滤光片已经置于黑色金属圈中,并且有箭头标识安装的方向:

激发滤光片箭头方向与光源相背离并指向二向色镜。

发射滤镜的箭头方向与二向色镜相背离并指向人眼或者相机。

需要特别注意的是二向色镜,您需要将有标识的膜面朝向观测的样本来安装方能实现滤光片的最大性能。

已经说到这,我们再来简单回顾下荧光滤光片套装中各自滤光片的基本性能:

激发滤光片,只允许激发波长峰值附近的窄带波长通过。如下图,DAPI荧光蛋白的激发滤光片只允许365±25nm的波长通过;其余远离带通波段的波长部分甚至被完全阻截。

二向色镜,主要是用来反射波长小于截止波长的光,透过其它的波长。一般情况二向色镜的截止波长是指透过率等于50%的波长。上图中,二向色镜(MD405)的截止波长约为405 nm,它既反射了390nm之前的波长,同时又透过了约为410nm之后的波长。

由此可见,二向色镜在荧光显微镜中起着至关重要的作用,但在阻挡不必要的光束时还不够理想;通常情况下,波长小于截止波长的光有大约90%被二向色镜反射,而波长大于这个值的光大约有90%透射,导致仍会有少许激发光和被激发的荧光一起透过二向色镜。也因此需要发射滤光片的配合才能达到观测的效果。

发射滤光片,能让样品产生的荧光到达探测系统便于人眼或者设备识别观测,同时截止不必要的激发光。同理,发射滤光片只允许荧光发射波长峰值附近的波长通过。上图中的发射滤光片只允许445±50nm的波长通过,其余远离带通波段的波长被完全阻截。从而实现高透射率,信号明亮,深截止背景幽暗不串色等的最理想观测效果。