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选择荧光滤光片时需要注意什么?

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1.什么是荧光滤光片?

荧光滤光片是生物医学和生命科学仪器中使用的关键部件。

其主要功能是在生物医学荧光检测分析系统中对物质激发光和发射荧光的特征波段光谱进行分离和选择。

一般来说,荧光滤光片组由三种不同的滤光片组成。

①激发滤光片(尺寸φ25×5mm)

②发射滤光片( 尺寸φ25×3.5mm )

③二向色镜(尺寸25.7×36×1mm)

激发滤光片负责选择合适的激发光波长,如将白色激发光筛选成蓝光,用于激发GFP等荧光素。

(注:若使用单波长 LED 光源,可省略激发滤光片。)

发射滤光片负责筛选所需的荧光发射光。当激发光激发不同的发射光时,发射滤光片可以区分不同的发射光。 另外,由于很多生物组织都有自发荧光,而自发荧光多在红色区域,所以可以使用发射滤光片滤除自发荧光的干扰。

(注:如果样品中只有一种荧光且没有自发荧光干扰,发射滤光片可以省略。)

二向色镜是区分激发光和发射光的,所以它的作用非常重要。

2.荧光滤光片的特点:

深度阻断,自发荧光低,平整度好,有助于获得清晰的荧光成像。 因此,好的荧光滤光片采用单片透明玻璃(如B270、熔融石英)作为基材,在玻璃的两面镀膜。 与使用多片胶合玻璃或吸收玻璃辅助截止的常规荧光滤光片相比,单片式在荧光成像方面优势明显,生产难度较高,因此成本也会较高。

Optolong荧光滤光片镀在单片透明玻璃上,双面镀膜。

3.荧光滤光片的应用:

荧光滤光片广泛应用于生命科学和生物医学的仪器,包括荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜(LSCM)、共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜(TIRFM)、流式细胞仪、RT-PCR等。

4.如何选择合适的荧光滤光片:

如何为我们的实验选择合适的荧光滤光片?

选择荧光滤光片的原则是在成像端尽可能让荧光/发射光通过,同时完全阻挡激发光,以获得最高的信噪比。

特别是对于多光子激发和全内反射显微镜的应用,微弱的噪声会对成像效果造成很大的干扰,因此要求信噪比更高。

通常我们看滤光片的透射光谱,但是对于荧光滤光片的选择,我们需要参考截止光谱。

在选择激发滤光片和发射滤光片时,两个滤光片的交叉点OD值是一个重要的标准。 一般要求光源激发的交点OD大于OD5,激光激发大于OD6,以达到较好的荧光信噪比。

有时激发透射光谱和发射透射光谱的组合看起来很完美,但转换为OD值后发现光谱交点仅为OD1,不符合荧光成像的基本要求。 因此,一般建议激发光和发射光的透射光谱有一定的距离,比如10nm。

荧光素也可用于选择过滤光片。 首先,我们需要确定我们正在使用的荧光素的激发和发射光谱。 然后将滤光片光谱和荧光素光谱重叠以确定滤光片的适用性。

当然,在选择滤光片时,还需要考虑激发光源的光谱,尤其是汞灯、金属卤化物灯和白光LED,避免选择光源较弱的区域。